Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora.Utilitzeu els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora, o utilitzeu els botons lliscants al final per moure's per tres diapositives alhora.
Es va desenvolupar un espectròmetre de nou colors ultracompacte (54 × 58 × 8,5 mm) i de gran obertura (1 × 7 mm), "dividit en dos" per una sèrie de deu miralls dicroics, que es va utilitzar per a la imatge espectral instantània.El flux de llum incident amb una secció transversal més petita que la mida de l'obertura es divideix en una franja contínua de 20 nm d'ample i nou fluxos de color amb longituds d'ona centrals de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 i 690 nm.Les imatges de nou corrents de color es mesuren simultàniament de manera eficient pel sensor d'imatge.A diferència de les matrius de miralls dicroics convencionals, la matriu de miralls dicroics desenvolupats té una configuració única de dues peces, que no només augmenta el nombre de colors que es poden mesurar simultàniament, sinó que també millora la resolució d'imatge per a cada flux de color.L'espectròmetre de nou colors desenvolupat s'utilitza per a l'electroforesi de quatre capil·lars.Anàlisi quantitativa simultània de vuit colorants que migren simultàniament a cada capil·lar mitjançant fluorescència induïda per làser de nou colors.Com que l'espectròmetre de nou colors no només és ultra petit i econòmic, sinó que també té un alt flux lluminós i una resolució espectral suficient per a la majoria d'aplicacions d'imatge espectral, es pot utilitzar àmpliament en diversos camps.
La imatge hiperespectral i multiespectral s'ha convertit en una part important de l'astronomia2, la teledetecció per a l'observació de la Terra3,4, el control de la qualitat dels aliments i l'aigua5,6, la conservació de l'art i l'arqueologia7, la medicina forense8, la cirurgia9, l'anàlisi i el diagnòstic biomèdic10,11, etc. Camp 1 Una tecnologia indispensable ,12,13.Els mètodes per mesurar l'espectre de llum emesa per cada punt d'emissió en el camp de visió es divideixen en (1) exploració puntual ("escombra")14,15, (2) exploració lineal ("panícula")16,17,18 , (3) la longitud explora ones19,20,21 i (4) imatges22,23,24,25.En el cas de tots aquests mètodes, la resolució espacial, la resolució espectral i la resolució temporal tenen una relació de compensació9,10,12,26.A més, la sortida de llum té un impacte important en la sensibilitat, és a dir, la relació senyal-soroll en la imatge espectral26.El flux lluminós, és a dir, l'eficiència de l'ús de la llum, és directament proporcional a la relació entre la quantitat real de llum mesurada de cada punt lluminós per unitat de temps a la quantitat total de llum del rang de longitud d'ona mesurada.La categoria (4) és un mètode adequat quan la intensitat o l'espectre de la llum emesa per cada punt emissor canvia amb el temps o quan la posició de cada punt emissor canvia amb el temps perquè l'espectre de la llum emesa per tots els punts emissors es mesura simultàniament.24.
La majoria dels mètodes anteriors es combinen amb espectròmetres grans, complexos i/o cars que utilitzen 18 reixes o 14, 16, 22, 23 prismes per a les classes (1), (2) i (4) o 20, 21 discs de filtre, filtres de líquids .Filtres ajustables cristal·lins (LCTF)25 o filtres ajustables acústico-òptics (AOTF)19 de la categoria (3).En canvi, els espectròmetres multimirall de la categoria (4) són petits i econòmics a causa de la seva senzilla configuració27,28,29,30.A més, tenen un flux lluminós elevat perquè la llum que comparteix cada mirall dicroic (és a dir, la llum transmesa i reflectida de la llum incident a cada mirall dicroic) s'utilitza de manera completa i continuada.Tanmateix, el nombre de bandes de longitud d'ona (és a dir, colors) que s'han de mesurar simultàniament està limitat a unes quatre.
La imatge espectral basada en la detecció de fluorescència s'utilitza habitualment per a l'anàlisi múltiple en detecció i diagnòstic biomèdic 10, 13 .En la multiplexació, atès que diversos analits (per exemple, ADN o proteïnes específics) estan marcats amb diferents colorants fluorescents, cada analit present en cada punt d'emissió del camp de visió es quantifica mitjançant anàlisi multicomponent.32 desglossa l'espectre de fluorescència detectat emès per cada punt d'emissió.Durant aquest procés, diferents colorants, cadascun amb una fluorescència diferent, poden colocalitzar-se, és a dir, coexistir en l'espai i el temps.Actualment, el nombre màxim de colorants que es poden excitar amb un sol feix làser és de vuit33.Aquest límit superior no està determinat per la resolució espectral (és a dir, el nombre de colors), sinó per l'amplada de l'espectre de fluorescència (≥50 nm) i la quantitat de colorant que es desplaça Stokes (≤200 nm) a FRET (utilitzant FRET)10 .Tanmateix, el nombre de colors ha de ser superior o igual al nombre de colorants per eliminar la superposició espectral de colorants barrejats31,32.Per tant, cal augmentar el nombre de colors mesurats simultàniament a vuit o més.
Recentment, s'ha desenvolupat un espectròmetre heptacroic ultracompacte (que utilitza una sèrie de miralls hepticroics i un sensor d'imatge per mesurar quatre fluxos fluorescents).L'espectròmetre és de dos a tres ordres de magnitud més petit que els espectròmetres convencionals que utilitzen reixes o prismes34,35.Tanmateix, és difícil col·locar més de set miralls dicroics en un espectròmetre i mesurar simultàniament més de set colors36,37.Amb un augment del nombre de miralls dicroics, augmenta la diferència màxima en les longituds dels camins òptics dels fluxos de llum dicroics i es fa difícil mostrar tots els fluxos de llum en un pla sensorial.La longitud del camí òptic més llarg del flux de llum també augmenta, de manera que l'amplada de l'obertura de l'espectròmetre (és a dir, l'amplada màxima de la llum analitzada per l'espectròmetre) disminueix.
En resposta als problemes anteriors, es va desenvolupar un espectròmetre ultracompacte de nou colors amb una matriu de miralls decacromàtics "dicroics" de dues capes i un sensor d'imatge per a imatges espectrals instantànies [categoria (4)].En comparació amb els espectròmetres anteriors, l'espectròmetre desenvolupat té una diferència més petita en la longitud màxima del camí òptic i una longitud màxima del camí òptic més petita.S'ha aplicat a l'electroforesi de quatre capil·lars per detectar la fluorescència de nou colors induïda per làser i per quantificar la migració simultània de vuit colorants a cada capil·lar.Com que l'espectròmetre desenvolupat no només és ultra petit i barat, sinó que també té un flux lluminós elevat i una resolució espectral suficient per a la majoria d'aplicacions d'imatge espectral, es pot utilitzar àmpliament en diversos camps.
L'espectròmetre tradicional de nou colors es mostra a la fig.1a.El seu disseny segueix el de l'anterior espectròmetre ultrapetit de set colors 31. Consta de nou miralls dicroics disposats horitzontalment en un angle de 45° cap a la dreta, i el sensor d'imatge (S) està situat per sobre dels nou miralls dicroics.La llum que entra per sota (C0) es divideix per una matriu de nou miralls dicroics en nou fluxos de llum que pugen (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 i C9).Els nou flux de color s'alimenten directament al sensor d'imatge i es detecten simultàniament.En aquest estudi, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 i C9 estan per ordre de longitud d'ona i estan representats per magenta, violeta, blau, cian, verd, groc, taronja, vermell-taronja i vermell, respectivament.Tot i que aquestes designacions de colors s'utilitzen en aquest document, tal com es mostra a la figura 3, perquè difereixen dels colors reals que veu l'ull humà.
Esquemes d'espectròmetres de nou colors convencionals i nous.(a) Espectròmetre convencional de nou colors amb una matriu de nou miralls dicroics.(b) Nou espectròmetre de nou colors amb una matriu de miralls dicroics de dues capes.El flux de llum incident C0 es divideix en nou fluxos de llum de colors C1-C9 i detectat pel sensor d'imatge S.
El nou espectròmetre de nou colors desenvolupat té una reixa de mirall dicroic de dues capes i un sensor d'imatge, tal com es mostra a la figura 1b.Al nivell inferior, cinc miralls dicroics estan inclinats 45° cap a la dreta, alineats a la dreta des del centre de la matriu de decàmers.Al nivell superior, cinc miralls dicroics addicionals estan inclinats 45° cap a l'esquerra i situats des del centre cap a l'esquerra.El mirall dicroic més esquerre de la capa inferior i el mirall dicroic més a la dreta de la capa superior se superposen.El flux de llum incident (C0) es divideix des de baix en quatre fluxos cromàtics sortints (C1-C4) per cinc miralls dicroics a la dreta i cinc fluxos cromàtics sortints (C5-C4) per cinc miralls dicroics a l'esquerra C9).Igual que els espectròmetres convencionals de nou colors, els nou flux de colors s'injecten directament al sensor d'imatge (S) i es detecten simultàniament.Comparant les figures 1a i 1b, es pot veure que en el cas del nou espectròmetre de nou colors, tant la diferència màxima com la longitud del camí òptic més llarg dels nou fluxos de color es redueixen a la meitat.
La construcció detallada d'una matriu de miralls dicroics ultra petit de dues capes de 29 mm (amplada) × 31 mm (profunditat) × 6 mm (alçada) es mostra a la figura 2. La matriu de miralls dicroics decimals consta de cinc miralls dicroics a la dreta. (M1-M5) i cinc miralls dicroics a l'esquerra (M6-M9 i un altre M5), cada mirall dicroic està fixat al suport d'alumini superior.Tots els miralls dicroics estan escalonats per compensar el desplaçament paral·lel a causa de la refracció del flux a través dels miralls.Per sota de M1, es fixa un filtre de pas de banda (BP).Les dimensions M1 i BP són 10 mm (costat llarg) x 1,9 mm (costat curt) x 0,5 mm (gruix).Les dimensions dels miralls dicroics restants són de 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.El pas de la matriu entre M1 i M2 és d'1,7 mm, mentre que el pas de la matriu d'altres miralls dicroics és d'1,6 mm.A la fig.La figura 2c combina el flux de llum incident C0 i nou fluxos de llum de colors C1-C9, separats per una matriu de miralls sense cambra.
Construcció d'una matriu de mirall dicroic de dues capes.(a) Una vista en perspectiva i (b) una vista en secció transversal d'una matriu de miralls dicroics de dues capes (dimensions 29 mm x 31 mm x 6 mm).Consta de cinc miralls dicroics (M1-M5) situats a la capa inferior, cinc miralls dicroics (M6-M9 i un altre M5) situats a la capa superior i un filtre passabanda (BP) situat per sota de M1.(c) Vista en secció transversal en direcció vertical, amb superposició C0 i C1-C9.
L'amplada de l'obertura en la direcció horitzontal, indicada per l'amplada C0 a la figura 2, c, és d'1 mm, i en la direcció perpendicular al pla de la figura 2, c, donada pel disseny del suport d'alumini, – 7 mm.És a dir, el nou espectròmetre de nou colors té una gran mida d'obertura d'1 mm × 7 mm.El camí òptic de C4 és el més llarg entre C1-C9 i el camí òptic de C4 dins de la matriu de miralls dicroics, a causa de la mida ultra petita anterior (29 mm × 31 mm × 6 mm), és de 12 mm.Al mateix temps, la longitud del camí òptic de C5 és la més curta entre C1-C9 i la longitud del camí òptic de C5 és de 5,7 mm.Per tant, la diferència màxima en la longitud del camí òptic és de 6,3 mm.Les longituds del camí òptic anteriors es corregeixen per a la longitud del camí òptic per a la transmissió òptica de M1-M9 i BP (del quars).
Les propietats espectrals de М1−М9 i VR es calculen de manera que els fluxos С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 i С9 estiguin en el rang de longituds d'ona 520–540, 540–560, 560, 65, 60, 6 –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 i 680–700 nm, respectivament.
A la figura 3a es mostra una fotografia de la matriu fabricada de miralls decacromàtics.M1-M9 i BP estan enganxats al pendent de 45 graus i al pla horitzontal del suport d'alumini, respectivament, mentre que M1 i BP estan ocults a la part posterior de la figura.
Producció d'una sèrie de miralls decans i la seva demostració.(a) Un conjunt de miralls decacromàtics fabricats.(b) Una imatge dividida en nou colors d'1 mm × 7 mm projectada sobre un full de paper col·locat davant d'una sèrie de miralls decacromàtics i retroil·luminat amb llum blanca.(c) Una sèrie de miralls decocromàtics il·luminats amb llum blanca des del darrere.(d) Corrent de divisió de nou colors que emana de la matriu de miralls de decà, observat col·locant un recipient acrílic ple de fum davant de la matriu de miralls de decà a c i enfosquint l'habitació.
A les Figs.4a.Els espectres de transmissió de C1-C9 en relació amb C0 es mostren a les Figs.4b.Aquests espectres es van calcular a partir dels espectres de les Figs.4a d'acord amb el camí òptic C1-C9 de la figura 4a.1b i 2c.Per exemple, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], on TS(X) i [ 1 − TS(X)] són els espectres de transmissió i reflexió de X, respectivament.Com es mostra a la figura 4b, les amplades de banda (amplada de banda ≥50%) de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 i C9 són 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 i 682-699 nm.Aquests resultats són coherents amb els intervals desenvolupats.A més, l'eficiència d'utilització de la llum C0 és alta, és a dir, la transmissió màxima mitjana de la llum C1-C9 és del 92%.
Espectres de transmissió d'un mirall dicroic i un flux dividit de nou colors.( a ) Espectres de transmissió mesurats de M1-M9 amb una incidència de 45 ° i BP amb una incidència de 0 °.( b ) Espectres de transmissió de C1-C9 en relació amb C0 calculats a partir de (a).
A la fig.A la figura 3c, la matriu de miralls dicroics es troba verticalment, de manera que el seu costat dret de la figura 3a és la part superior i el feix blanc del LED colimat (C0) està retroil·luminat.La matriu de miralls decacromàtics que es mostra a la figura 3a està muntada en un adaptador de 54 mm (alçada) × 58 mm (profunditat) × 8,5 mm (gruix).A la fig.3d, a més de l'estat que es mostra a la fig.A la figura 3c, es va col·locar un dipòsit acrílic ple de fum davant d'una sèrie de miralls decocromàtics, amb els llums de l'habitació apagats.Com a resultat, nou corrents dicroiques són visibles al tanc, que emanen d'una sèrie de miralls decatroics.Cada corrent dividit té una secció transversal rectangular amb unes dimensions d'1 × 7 mm, que correspon a la mida de l'obertura del nou espectròmetre de nou colors.A la figura 3b, es col·loca un full de paper davant de la matriu de miralls dicroics de la figura 3c i s'observa una imatge d'1 x 7 mm de nou corrents dicroics projectats al paper des de la direcció del moviment del paper.corrents.Els nou corrents de separació de colors de la fig.3b i d són C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 i C9 de dalt a baix, que també es poden veure a les figures 1 i 2. 1b i 2c.S'observen en colors corresponents a les seves longituds d'ona.A causa de la baixa intensitat de la llum blanca del LED (vegeu la figura complementària S3) i la sensibilitat de la càmera de color utilitzada per capturar C9 (682–699 nm) a la figura. Altres fluxos de divisió són febles.De la mateixa manera, C9 era feblement visible a ull nu.Mentrestant, C2 (el segon corrent des de la part superior) sembla verd a la figura 3, però sembla més groc a simple vista.
La transició de la figura 3c a d es mostra al vídeo suplementari 1. Immediatament després que la llum blanca del LED passi per la matriu de miralls decacromàtics, es divideix simultàniament en nou flux de colors.Al final, el fum de la tina es va anar dissipant de dalt a baix, de manera que les nou pols de colors també van desaparèixer de dalt a baix.En canvi, al vídeo suplementari 2, quan la longitud d'ona del flux de llum incident a la matriu de miralls decacromàtics es va canviar de llarg a curt de l'ordre de 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 i 532 nm. ., Només es mostren els fluxos dividits corresponents dels nou fluxos dividits en l'ordre de C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 i C1.El dipòsit acrílic es substitueix per una piscina de quars i es poden observar clarament els flocs de cada flux desviat des de la direcció cap amunt.A més, el subvídeo 3 s'edita de manera que es reprodueixi la part del canvi de longitud d'ona del subvídeo 2.Aquesta és l'expressió més eloqüent de les característiques d'un conjunt decocromàtic de miralls.
Els resultats anteriors mostren que la matriu de miralls decacromàtics fabricada o el nou espectròmetre de nou colors funciona com es pretén.El nou espectròmetre de nou colors es forma muntant una matriu de miralls decacromàtics amb adaptadors directament a la placa del sensor d'imatge.
Flux lluminós amb un rang de longitud d'ona de 400 a 750 nm, emès per quatre punts de radiació φ50 μm, situats a intervals d'1 mm en la direcció perpendicular al pla de la figura 2c, respectivament. Investigacions 31, 34. La matriu de quatre lents consta de quatre lents φ1 mm amb una distància focal d'1,4 mm i un pas d'1 mm.Quatre corrents col·limats (quatre C0) incideixen al DP d'un nou espectròmetre de nou colors, espaiats a intervals d'1 mm.Una matriu de miralls dicroics divideix cada corrent (C0) en nou corrents de color (C1-C9).Els 36 fluxos resultants (quatre conjunts de C1-C9) s'injecten directament en un sensor d'imatge CMOS (S) connectat directament a una matriu de miralls dicroics.Com a resultat, tal com es mostra a la figura 5a, a causa de la petita diferència màxima del camí òptic i del recorregut òptic màxim curt, les imatges dels 36 fluxos es van detectar simultàniament i clarament amb la mateixa mida.Segons els espectres aigües avall (vegeu la figura suplementària S4), la intensitat de la imatge dels quatre grups C1, C2 i C3 és relativament baixa.Trenta-sis imatges tenien una mida de 0,57 ± 0,05 mm (mitjana ± SD).Així, l'ampliació de la imatge va ser de mitjana 11,4.L'espaiat vertical entre imatges és de mitjana 1 mm (mateix espai que una matriu de lents) i l'espaiat horitzontal és d'1,6 mm (mateix espai que una matriu de miralls dicroics).Com que la mida de la imatge és molt més petita que la distància entre imatges, cada imatge es pot mesurar de manera independent (amb poca diafonia).Mentrestant, a la figura 5 B es mostren imatges de vint-i-vuit corrents enregistrades per l'espectròmetre convencional de set colors utilitzat en el nostre estudi anterior. La matriu de set miralls dicroics es va crear eliminant els dos miralls dicroics més a la dreta de la matriu de nou dicroics. miralls de la figura 1a.No totes les imatges són nítides, la mida de la imatge augmenta de C1 a C7.Vint-i-vuit imatges tenen una mida de 0,70 ± 0,19 mm.Per tant, és difícil mantenir una alta resolució d'imatge en totes les imatges.El coeficient de variació (CV) de la mida de la imatge 28 a la figura 5b va ser del 28%, mentre que el CV de la mida de la imatge 36 a la figura 5a va disminuir al 9%.Els resultats anteriors mostren que el nou espectròmetre de nou colors no només augmenta el nombre de colors mesurats simultàniament de set a nou, sinó que també té una alta resolució d'imatge per a cada color.
Comparació de la qualitat de la imatge dividida formada per espectròmetres convencionals i nous.( a ) Quatre grups d'imatges separades de nou colors (C1-C9) generades pel nou espectròmetre de nou colors.(b) Quatre conjunts d'imatges separades de set colors (C1-C7) formats amb un espectròmetre convencional de set colors.Els fluxos (C0) amb longituds d'ona de 400 a 750 nm des de quatre punts d'emissió es col·limen i incideixen a cada espectròmetre, respectivament.
Les característiques espectrals de l'espectròmetre de nou colors es van avaluar experimentalment i els resultats de l'avaluació es mostren a la figura 6. Tingueu en compte que la figura 6a mostra els mateixos resultats que la figura 5a, és a dir, a longituds d'ona de 4 C0 400–750 nm, es detecten les 36 imatges. (4 grups C1–C9).Per contra, com es mostra a la figura 6b–j, quan cada C0 té una longitud d'ona específica de 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 o 690 nm, gairebé només hi ha quatre imatges corresponents (quatre grups detectats C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 o C9).Tanmateix, algunes de les imatges adjacents a les quatre imatges corresponents es detecten molt feblement perquè els espectres de transmissió C1-C9 que es mostren a la figura 4b es superposen lleugerament i cada C0 té una banda de 10 nm a una longitud d'ona específica tal com es descriu al mètode.Aquests resultats són coherents amb els espectres de transmissió C1-C9 que es mostren a les Figs.4b i vídeos suplementaris 2 i 3. És a dir, l'espectròmetre de nou colors funciona com s'esperava segons els resultats que es mostren a la fig.4b.Per tant, es conclou que la distribució d'intensitat d'imatge C1-C9 és l'espectre de cada C0.
Característiques espectrals d'un espectròmetre de nou colors.El nou espectròmetre de nou colors genera quatre conjunts d'imatges separades de nou colors (C1-C9) quan la llum incident (quatre C0) té una longitud d'ona de (a) 400-750 nm (com es mostra a la figura 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, respectivament.
L'espectròmetre de nou colors desenvolupat es va utilitzar per a l'electroforesi de quatre capil·lars (per a més detalls, vegeu Materials suplementaris)31,34,35.La matriu de quatre capil·lars consta de quatre capil·lars (diàmetre exterior 360 μm i diàmetre interior 50 μm) situats a intervals d'1 mm al lloc d'irradiació làser.Mostres que contenen fragments d'ADN marcats amb 8 colorants, a saber, FL-6C (colorant 1), JOE-6C (colorant 2), dR6G (colorant 3), TMR-6C (colorant 4), CXR-6C (colorant 5), TOM- 6C (colorant 6), LIZ (colorant 7) i WEN (colorant 8) en ordre ascendent de longitud d'ona fluorescent, separats en cadascun dels quatre capil·lars (d'ara endavant anomenats Cap1, Cap2, Cap3 i Cap4).La fluorescència induïda per làser de Cap1-Cap4 es va col·limar amb una matriu de quatre lents i es va registrar simultàniament amb un espectròmetre de nou colors.La dinàmica d'intensitat de la fluorescència de nou colors (C1-C9) durant l'electroforesi, és a dir, un electroforegrama de nou colors de cada capil·lar, es mostra a la figura 7a.S'obté un electroforegrama equivalent de nou colors a Cap1-Cap4.Tal com indiquen les fletxes Cap1 de la figura 7a, els vuit pics de cada electroforegrama de nou colors mostren una emissió de fluorescència de Dye1-Dye8, respectivament.
Quantificació simultània de vuit colorants mitjançant un espectròmetre d'electroforesi de quatre capil·lars de nou colors.(a) Electroforegrama de nou colors (C1-C9) de cada capil·lar.Els vuit pics indicats per les fletxes Cap1 mostren emissions de fluorescència individuals de vuit colorants (Dye1-Dye8).Els colors de les fletxes corresponen als colors (b) i (c).( b ) Espectres de fluorescència de vuit colorants (Dye1-Dye8) per capil·lar.c Electroferogrames de vuit colorants (Dye1-Dye8) per capil·lar.Els pics dels fragments d'ADN marcats amb Dye7 s'indiquen amb fletxes i s'indiquen les seves longituds de base Cap4.
Les distribucions d'intensitat de C1-C9 en vuit pics es mostren a les Figs.7b, respectivament.Com que tant C1-C9 com Dye1-Dye8 estan en ordre de longitud d'ona, les vuit distribucions de la figura 7b mostren els espectres de fluorescència de Dye1-Dye8 seqüencialment d'esquerra a dreta.En aquest estudi, Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 i Dye8 apareixen en magenta, violeta, blau, cian, verd, groc, taronja i vermell, respectivament.Tingueu en compte que els colors de les fletxes de la figura 7a corresponen als colors del colorant de la figura 7b.Les intensitats de fluorescència C1-C9 per a cada espectre de la figura 7b es van normalitzar de manera que la seva suma sigui igual a un.Es van obtenir vuit espectres de fluorescència equivalents de Cap1-Cap4.Es pot observar clarament la superposició espectral de la fluorescència entre el colorant 1-colorant 8.
Tal com es mostra a la figura 7c, per a cada capil·lar, l'electroforegrama de nou colors de la figura 7a es va convertir en un electroferograma de vuit colorants mitjançant una anàlisi multicomponent basada en els vuit espectres de fluorescència de la figura 7b (vegeu Materials suplementaris per a més detalls).Com que la superposició espectral de la fluorescència a la figura 7a no es mostra a la figura 7c, Dye1-Dye8 es pot identificar i quantificar individualment en cada moment, fins i tot si diferents quantitats de Dye1-Dye8 fluoreixen al mateix temps.Això no es pot fer amb la detecció tradicional de set colors31, però es pot aconseguir amb la detecció de nou colors desenvolupada.Tal com mostren les fletxes Cap1 a la figura 7c, només els singlets d'emissió fluorescent Dye3 (blau), Dye8 (vermell), Dye5 (verd), Dye4 (cian), Dye2 (morat), Dye1 (magenta) i Dye6 (groc). ) s'observen en l'ordre cronològic esperat.Per a l'emissió fluorescent del colorant 7 (taronja), a més del pic únic indicat per la fletxa taronja, es van observar diversos altres pics únics.Aquest resultat es deu al fet que les mostres contenien estàndards de mida, fragments d'ADN marcats amb Dye7 amb diferents longituds de bases.Com es mostra a la figura 7c, per a Cap4 aquestes longituds base són 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 i 220.
Les principals característiques de l'espectròmetre de nou colors, desenvolupat amb una matriu de miralls dicroics de dues capes, són de mida petita i un disseny senzill.Atès que la matriu de miralls decacromàtics dins de l'adaptador que es mostra a la fig.3c muntat directament a la placa del sensor d'imatge (vegeu Fig. S1 i S2), l'espectròmetre de nou colors té les mateixes dimensions que l'adaptador, és a dir, 54 × 58 × 8,5 mm.(gruix).Aquesta mida ultra petita és de dos a tres ordres de magnitud més petit que els espectròmetres convencionals que utilitzen reixes o prismes.A més, com que l'espectròmetre de nou colors està configurat de manera que la llum incideix perpendicularment sobre la superfície del sensor d'imatge, l'espai es pot assignar fàcilment per a l'espectròmetre de nou colors en sistemes com ara microscopis, citòmetres de flux o analitzadors.Analitzador d'electroforesi de reixeta capil·lar per a una miniaturització encara més gran del sistema.Al mateix temps, la mida de deu miralls dicroics i filtres de pas de banda utilitzats a l'espectròmetre de nou colors és de només 10 × 1,9 × 0,5 mm o 15 × 1,9 × 0,5 mm.Així, més de 100 petits miralls dicroics i filtres de pas de banda, respectivament, es poden tallar d'un mirall dicroic i d'un filtre de pas de banda de 60 mm2, respectivament.Per tant, es poden fabricar una sèrie de miralls decacromàtics a baix cost.
Una altra característica de l'espectròmetre de nou colors són les seves excel·lents característiques espectrals.En particular, permet l'adquisició d'imatges espectrals de les instantànies, és a dir, l'adquisició simultània d'imatges amb informació espectral.Per a cada imatge, es va obtenir un espectre continu amb un rang de longitud d'ona de 520 a 700 nm i una resolució de 20 nm.En altres paraules, es detecten nou intensitats de llum de color per a cada imatge, és a dir, nou bandes de 20 nm que divideixen en parts iguals el rang de longitud d'ona de 520 a 700 nm.En canviar les característiques espectrals del mirall dicroic i del filtre de pas de banda, es pot ajustar el rang de longitud d'ona de les nou bandes i l'amplada de cada banda.La detecció de nou colors es pot utilitzar no només per a mesures de fluorescència amb imatges espectrals (tal com es descriu en aquest informe), sinó també per a moltes altres aplicacions habituals que utilitzen imatges espectrals.Tot i que les imatges hiperespectrals poden detectar centenars de colors, s'ha trobat que fins i tot amb una reducció significativa del nombre de colors detectables, es poden identificar múltiples objectes en el camp de visió amb prou precisió per a moltes aplicacions38,39,40.Com que la resolució espacial, la resolució espectral i la resolució temporal tenen una compensació en la imatge espectral, reduir el nombre de colors pot millorar la resolució espacial i temporal.També pot utilitzar espectròmetres simples com el desenvolupat en aquest estudi i reduir encara més la quantitat de càlcul.
En aquest estudi, es van quantificar vuit colorants simultàniament mitjançant la separació espectral dels seus espectres de fluorescència superposats a partir de la detecció de nou colors.Es poden quantificar simultàniament fins a nou colorants, coexistint en el temps i l'espai.Un avantatge especial de l'espectròmetre de nou colors és el seu alt flux lluminós i la seva gran obertura (1 × 7 mm).La matriu de miralls de decà té una transmissió màxima del 92% de la llum des de l'obertura en cadascun dels nou rangs de longitud d'ona.L'eficiència d'utilitzar llum incident en el rang de longitud d'ona de 520 a 700 nm és gairebé del 100%.En una gamma tan àmplia de longituds d'ona, cap xarxa de difracció pot proporcionar una eficiència d'ús tan alta.Fins i tot si l'eficiència de difracció d'una xarxa de difracció supera el 90% a una determinada longitud d'ona, a mesura que augmenta la diferència entre aquesta longitud d'ona i una determinada longitud d'ona, l'eficiència de difracció a una altra longitud d'ona disminueix41.L'amplada de l'obertura perpendicular a la direcció del pla de la figura 2c es pot estendre des de 7 mm fins a l'amplada del sensor d'imatge, com en el cas del sensor d'imatge utilitzat en aquest estudi, modificant lleugerament la matriu de decamers.
L'espectròmetre de nou colors es pot utilitzar no només per a l'electroforesi capil·lar, com es mostra en aquest estudi, sinó també per a diversos altres propòsits.Per exemple, com es mostra a la figura següent, es pot aplicar un espectròmetre de nou colors a un microscopi de fluorescència.El pla de la mostra es mostra al sensor d'imatge de l'espectròmetre de nou colors a través d'un objectiu 10x.La distància òptica entre la lent de l'objectiu i el sensor d'imatge és de 200 mm, mentre que la distància òptica entre la superfície incident de l'espectròmetre de nou colors i el sensor d'imatge és de només 12 mm.Per tant, la imatge es va tallar aproximadament a la mida de l'obertura (1 × 7 mm) en el pla d'incidència i es va dividir en nou imatges de color.És a dir, es pot fer una imatge espectral d'una instantània de nou colors en una àrea de 0,1 × 0,7 mm del pla de mostra.A més, és possible obtenir una imatge espectral de nou colors d'una àrea més gran del pla de la mostra escanejant la mostra en relació amb l'objectiu en direcció horitzontal a la figura 2c.
Els components de la matriu de miralls decacromàtics, és a dir, M1-M9 i BP, van ser fets a mida per Asahi Spectra Co., Ltd. mitjançant mètodes de precipitació estàndard.Els materials dielèctrics multicapa es van aplicar individualment a deu plaques de quars de 60 × 60 mm de mida i 0,5 mm de gruix, complint els requisits següents: M1: IA = 45 °, R ≥ 90% a 520–590 nm, Tave ≥ 90% a 610– 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90% a 520–530 nm, Tave ≥ 90% a 550–600 nm, M3: IA = 45°, R ≥ 90% a 540–550 nm, Tave ≥ 90 % a 570–600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90% a 560–570 nm, Tave ≥ 90% a 590–600 nm, M5: IA = 45°, R ≥ 98% a 580–600 nm , R ≥ 98% a 680–700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90% a 600–610 nm, R ≥ 90% a 630–700 nm, M7: IA = 45°, R ≥ 90% 620–630 nm, Taw ≥ 90% a 650–700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90% a 640–650 nm, Taw ≥ 90% a 670–700 nm, M9: IA = 45°, ≥ 90% a 650-670 nm, Tave ≥ 90% a 690-700 nm, BP: IA = 0°, T ≤ 0,01% a 505 nm, Tave ≥ 95% a 530-690 nm a 530-690 nm T≥ 530% a -690 nm i T ≤ 1% a 725-750 nm, on IA, T, Tave i R són l'angle d'incidència, transmitància, transmitància mitjana i reflectància de la llum no polaritzada.
La llum blanca (C0) amb un rang de longituds d'ona de 400 a 750 nm emesa per una font de llum LED (AS 3000, AS ONE CORPORATION) va ser col·limada i incidint verticalment al DP d'una sèrie de miralls dicroics.L'espectre de llum blanca dels LED es mostra a la figura complementària S3.Col·loqueu un dipòsit acrílic (dimensions 150 × 150 × 30 mm) directament davant de la matriu de miralls de la càmera, davant de la PSU.El fum generat quan es va submergir el gel sec a l'aigua es va abocar a un dipòsit acrílic per observar els corrents dividits C1-C9 de nou colors que emanen de la sèrie de miralls decacromàtics.
Alternativament, la llum blanca col·limada (C0) es fa passar per un filtre abans d'entrar al DP.Els filtres eren originalment filtres de densitat neutra amb una densitat òptica de 0,6.A continuació, utilitzeu un filtre motoritzat (FW212C, FW212C, Thorlabs).Finalment, torneu a activar el filtre ND.Les amplades de banda dels nou filtres de pas de banda corresponen a C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 i C1, respectivament.Una cèl·lula de quars amb unes dimensions internes de 40 (longitud òptica) x 42,5 (alçada) x 10 mm (amplada) es va col·locar davant d'una sèrie de miralls decocromàtics, davant del BP.A continuació, el fum s'alimenta a través d'un tub a la cèl·lula de quars per mantenir la concentració de fum a la cèl·lula de quars per visualitzar els fluxos dividits C1-C9 de nou colors que emanen de la matriu de miralls decacromàtics.
Es va capturar un vídeo del flux de llum dividida de nou colors que emana d'una sèrie de miralls decànics en mode lapse de temps a l'iPhone XS.Captura imatges de l'escena a 1 fps i compila les imatges per crear vídeo a 30 fps (per al vídeo opcional 1) o 24 fps (per als vídeos opcionals 2 i 3).
Col·loqueu una placa d'acer inoxidable de 50 µm de gruix (amb quatre forats de 50 µm de diàmetre a intervals d'1 mm) a la placa de difusió.La llum amb una longitud d'ona de 400-750 nm s'irradia a la placa difusora, obtinguda fent passar llum d'una làmpada halògena a través d'un filtre de transmissió curt amb una longitud d'ona de tall de 700 nm.L'espectre de llum es mostra a la figura suplementària S4.Alternativament, la llum també passa per un dels filtres de pas de banda de 10 nm centrats a 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 i 690 nm i colpeja la placa difusora.Com a resultat, es van formar quatre punts de radiació amb un diàmetre de φ50 μm i diferents longituds d'ona en una placa d'acer inoxidable enfront de la placa difusora.
Una matriu de quatre capil·lars amb quatre lents està muntada en un espectròmetre de nou colors tal com es mostra a les figures 1 i 2. C1 i C2.Els quatre capil·lars i quatre lents eren els mateixos que en estudis anteriors31,34.Un feix làser amb una longitud d'ona de 505 nm i una potència de 15 mW s'irradia de manera simultània i uniforme des del costat fins als punts d'emissió de quatre capil·lars.La fluorescència emesa per cada punt d'emissió és col·limada per la lent corresponent i separada en nou corrents de color per una sèrie de miralls decacromàtics.Els 36 fluxos resultants es van injectar directament en un sensor d'imatge CMOS (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.), i les seves imatges es van gravar simultàniament.
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), es va barrejar 4 µl de colorant GeneScan™ 600 LIZ™ per a cada capil·lar barrejant 1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 µl estàndard de mida de barreja.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) i 14 µl d'aigua.El PowerPlex® 6C Matrix Standard consta de sis fragments d'ADN marcats amb sis colorants: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C i WEN, per ordre de longitud d'ona màxima.Les longituds de la base d'aquests fragments d'ADN no es divulguen, però es coneix la seqüència de longitud de base dels fragments d'ADN etiquetats amb WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C i TOM-6C.La barreja de l'ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit conté un fragment d'ADN marcat amb colorant dR6G.Les longituds de les bases dels fragments d'ADN tampoc es divulguen.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 inclou 36 fragments d'ADN marcats amb LIZ.Les longituds de base d'aquests fragments d'ADN són 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 300, 4, 30, 4, 3, 3 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 i 600 base.Les mostres es van desnaturalitzar a 94 °C durant 3 minuts, després es van refredar en gel durant 5 minuts.Les mostres es van injectar a cada capil·lar a 26 V/cm durant 9 s i es van separar en cada capil·lar ple amb una solució de polímer POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) amb una longitud efectiva de 36 cm i una tensió de 181 V/cm i un angle de 60°.DE.
Totes les dades obtingudes o analitzades en el transcurs d'aquest estudi s'inclouen en aquest article publicat i la seva informació addicional.Altres dades rellevants per a aquest estudi estan disponibles dels respectius autors a petició raonable.
Khan, MJ, Khan, HS, Yousaf, A., Khurshid, K. i Abbas, A. Tendències actuals en anàlisi d'imatges hiperespectrals: una revisió.Accediu a IEEE 6, 14118–14129.https://doi.org/10.1109/ACCESS.2018.2812999 (2018).
Vaughan, AH Espectroscòpia interferomètrica astronòmica Fabry-Perot.instal·lar.Reverend Astron.astrofísica.5, 139-167.https://doi.org/10.1146/annurev.aa.05.090167.001035 (1967).
Goetz, AFH, Wein, G., Solomon, JE i Rock, BN Espectroscòpia d'imatges de teledetecció terrestre.Ciència 228, 1147–1153.https://doi.org/10.1126/science.228.4704.1147 (1985).
Yokoya, N., Grohnfeldt, C. i Chanussot, J. Fusion of hyperspectral and multispectral data: a comparative review of recent publications.IEEE Ciències de la Terra.Revista de teledetecció.5:29–56.https://doi.org/10.1109/MGRS.2016.2637824 (2017).
Gowen, AA, O'Donnell, SP, Cullen, PJ, Downey, G. i Frias, JM La imatge hiperespectral és una nova eina analítica per al control de qualitat i la seguretat alimentària.Tendències en ciència dels aliments.tecnologia.18, 590-598.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2007.06.001 (2007).
ElMasri, G., Mandour, N., Al-Rejaye, S., Belin, E. i Rousseau, D. Aplicacions recents d'imatges multiespectrals per al seguiment del fenotip i la qualitat de les llavors: una revisió.Sensors 19, 1090 (2019).
Liang, H. Avenços en la imatge multiespectral i hiperespectral per a l'arqueologia i la preservació de l'art.Sol·liciteu un 106, 309–323 físic.https://doi.org/10.1007/s00339-011-6689-1 (2012).
Edelman GJ, Gaston E., van Leeuwen TG, Cullen PJ i Alders MKG Imatges hiperespectrals per a l'anàlisi sense contacte de rastres forenses.Criminalística.intern 223, 28-39.https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.09.012 (2012).
Hora de publicació: 10-gen-2023